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microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用加A尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Histan miRNA RT buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3'末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。后续qPCR中只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。此外，试剂盒中提供了人、大鼠、小鼠通用的U6内参上下游引物，可在宽广的区域内得到良好的标准曲线。本制品推荐与本公司的mircoRNA染料法qPCR试剂盒配套使用，以获得最优的实验结果。

• 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  
• 实验时，请使用无RNase污染的耗材，避免不必要的损失影响实验结果。
  
• 本制品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 配制反转录反应体系：
  室温融化Histan miRNA RT enzyme mix和2×Histan miRNA RT buffer后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配制反应体系。
  

  成分	用量	终浓度
  2×Histan miRNA RT buffer	5μL	1×
  Histan miRNA RT enzyme mix	1.75μL	-
  RNA	X μL	-
  RNase-free H2O至10μL	-

  • 总RNA及提取的miRNA的浓度范围10pg～2μg，合成的miRNA拷贝数最低可达60 copies，投入体积不超过3.25μL。
• 逆转录程序：
  移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应。
  

  反应温度	反应时间	备注
  37℃	50min	miRNA加A尾及反转录过程
  85℃	5sec	酶失活过程

  • 逆转录产物可直接进行下游qPCR检测。为避免逆转录体系对qPCR反应的抑制，可将产物稀释10～1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。若长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。